4中药血清谱效学研究瓶颈
中药血清谱效学研究环节中存在诸多研究瓶颈,中药状概如实验动物状态的血清学研选择、血样处理方案的谱效优化、中药血清多维谱效学的究现构建、合适数据处理方法的中药状概选择等问题对中药血清谱效学研究结果存在较大的影响,因此笔者就上述问题进行剖析,血清学研以期为后期中药血清谱效学深入研究提供参考。谱效
4.1实验动物状态的究现选择
中药血清药理学的精髓在于巧妙地利用了生物体对中药复杂成分的选择和滤过作用,使复杂研究得以简化,中药状概因此,血清学研选择不同生理状态的谱效实验动物对中药入血成分研究至关重要。尽管目前相关文献报道中多采用正常动物给药血清,究现但是中药状概有文献报道发现病理与正常状态下动物中药入血成分不一,如姚红锐等对比了正常状态和高脂血症模型状态下大鼠的血清学研含药血清,发现毛菊苣有效部位在正常大鼠中有6个入血成分,谱效但在高脂血症模型大鼠中仅检测到1个微量成分。王元清等研究高脂血症和正常大鼠给予淫藤骨痹康方总萜后体内代谢指纹图谱的差异,发现不同生理状态下大多数共有峰的峰面积存在显著性差异。由此可见,机体在病理状态下对中药的吸收、转化速率与正常生理状态下不同,因此,为使动物含药血清更精确地表征临床病理状态下的入血成分,应采用病理模型状态下的动物血清进行药物化学研究。
4.2优化血样处理方案
合适的血样处理方法是中药血清谱效学研究的基石,因此优化血样处理方法,尽可能多地保留血样中的化学成分已成为中药血清谱效学研究的核心问题之一。由于动物血清中含有多种内源性蛋白,严重干扰血中移行成分的检测分析,故应考虑首先除去血清中的蛋白质。目前常用蛋白处理方法有溶剂法、超滤法、加热法、柱色谱法等,其中去除蛋白质以溶剂法为主,分离纯化以萃取法为主。血清蛋白的处理方法各有特点:溶剂法主要包括有机溶剂沉淀、强酸溶液沉淀、液-液萃取等,具有操作简单、去除蛋白率高且较适合大样本处理的特点;柱色谱法具有分离效果好、回收率高、重现性良好,可避免乳化现象等优势,缺点是不适合大样本处理;超滤法操作简单,不需要改变样品的理化性质,适用于待测组分含量低、热稳定性差的情况,但可能引起部分成分滞留于膜上,从而造成某些成分含量减少;加热法操作简单,但不适合于热稳定差的化学成分。此外,在处理含药血清过程中,由于某些成分可能与纤维蛋白或血细胞吸附或结合,从而引起部分中药成分损失,因此,为较全面地研究血样中的化学成分,有学者提出可将血清和血浆药物化学二者结合进行相应研究。
4.3构建中药血清多维谱效学
中药血清药物化学认为中药有效物质必须以血液为介质输送到靶点,从而发挥药效作用,而且中药成分复杂,各种性质均有差别,各成分吸收部位或吸收速率也各不相同,且进入体内的方式也各不相同,致使单个化学指纹图谱难以全面表征中药入血成分。因此,为了准确得到中药化学成分在体内的动态变化及与药物原型成分的相互关联作用,建立能够较全面反映中药入血的血清药物化学动态图谱就变得尤为重要。基于此,业内学者在此基础上提出了中药多维谱效学,即使用不同仪器分析方法(检测器)来获取样品化学信息,通过综合多种仪器分析方法,建立信源不同、信息互补的多维指纹图谱,以便完整地表征中药复杂物质体系的整体化学特征。与此同时,由于中药是一个集化学成分和生物效应多样性的复杂体,因此,采用单一的药效指标难以全面反映中药的药效信息,孙莉琼等建议开展中药多维谱效学时选择多种活性指标,即从整体水平、组织器官和细胞分子水平等不同层次开展中药药效学研究,建立中药体内外多维药效信息。虽然多维谱效学尚未在中药血清谱效学中广泛开展,但随着中药血清谱效学的深入研究,相信该方法在揭示中药物质基础领域将发挥出独特的优势。
4.4选择合适的数据处理方法
中药血清谱效学研究中,谱与效需要通过数据提取与有机结合才能进一步揭示中药发挥药效的物质基础。目前,谱效关系数据处理方法不一,常用的数据处理方法优势与不足如下:(1)直观比较法:优势是简便易行,但是具有一定的主观性;(2)相关分析:能够给出峰与药效指标间的密切程度,包括相关性大小、显著程度及变化方向,但不能解释各个特征峰与药效的协同作用;(3)典型相关分析:其特点是可通过研究相关关系较大的几对典型变量,就可替代原来两组变量之间的相关关系研究;(4)灰色关联度分析:对数据的要求降低,原理简单,能够给出峰与药效的关联度大小,间接给出各峰对药效的贡献度,但无法给出各峰对药效的综合贡献度;(5)聚类分析:考察同类样品的共性特征和异类样品的差异特征,从整体的角度分析并比较不同指标的相似性及分类情况,排除相关性较差变量的影响,但无法体现各峰与药效的相关性大小和方向;(6)主成分分析:简化数据,能够对数据降维,缺点是提取的主成分数量小于原始变量数且不能给出2组分析变量的相关性大小和数学模型;(7)多元线性回归分析:主要是偏最小二乘回归分析,该方法在谱效关系数据处理中使用最为广泛,集多元线性回归、典型相关分析及主成分分析的基本功能为一体,消除自变量选取时可能存在的多重共线性问题,可以最大限度地利用数据信息,预测精确度高,结果易于解释,因此,建议采用偏最小二乘回归分析来进行中药血清“谱”与“效”的数据分析。
4.5其他问题
除上述瓶颈外,在开展中药血清谱效学研究时还需注意其他问题,如采血时间的选择和血清的处理方法等。采血时间应选择在服用药物后血药浓度达到最高值时,这样能够避免药物中的有效物质因代谢而减少,从而造成假阴性的结果。但是由于中药所含成分复杂、多样,给药后达峰值时间不同,因此给采血时间的选择带来了很大的难度。通过梳理相关文献发现,目前常用的给药次数和采血时间包括:(1)每日2次,连续给药3 d;(2)每日1次,连续给药7 d;(3)每日2次,连续给药5 d等采血方案。然而中药化学成分复杂,不同药物血药浓度达峰的时间不同,给采血时间的选取带来一定困难,因此笔者建议可结合药动学进行参数分析,通过药物入血指纹图谱和药动模型数据优化最佳采血时间。此外,目前体外药效学研究中含药血清的制备方法广泛采用56℃水浴加热,30 min灭活,微孔滤膜滤过,该方法较好地对血清中的酶、抗体、补体、细胞因子及其他生理活性物质进行灭活,减少可能会对体外培养的细胞、病毒、组织器官产生的影响,提高药效评价的准确度。然而有学者提出,血清一旦灭活血,由药物激发的血清中内生性成分(如补体、酶)将减少或丧失,进而影响药理作用。因此开展中药血清药物化学-药理学谱效关系时,笔者建议可设立正常血清空白组来排除血清内生性成分对实验结果的影响,从而获得全面反映中药真实的药效数据。
5结语与展望
中药血清谱效学是通过体内血清化学指纹图谱及相应的药效,通过数据处理方法,对机体与中药之间的相互作用进行探索,同时对中药发挥药效的物质基础进行快速的筛选,较好地体现了中医药整体观念的特点。然而,中药血清谱效学是建立在“只有入血成分才可能是药效成分”的假说基础之上,该理论也存在一些局限性,如外用中药或含多糖类中药不适合该理论。此外,如何采用现代语言来表征中医证侯学并将其应用于中药血清谱效学研究中,将传统中医药与现代西方医学进行对接,是推动中医药走向现代化和国际化的关键问题。基于此,王喜军教授提出了中医方证代谢组学,是以代谢组学技术建立方剂有效性评价体系,揭示证候生物学本质,以中药血清药物化学方法发现方剂体内直接作用物质,通过建立两者之间的相关性来表征与证候生物学本质相关的药效物质。笔者认为将中医方证代谢组学与中血清谱效学进行有机的整合,将进一步深化对传统中医辨证论治和整体观念的理解和发展,为中医药的国际化和现代化起到推波助澜的作用。
声明:本文所用图片、文字来源《中草药》2020年7月,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系
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